人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定

人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定目的从不同胚龄的人胚脑中分离培养出具有自我更新能力和多分化潜能的人胚神经干细胞（neuralstemcell，nsc）,应用悬浮及贴壁培养的方法长期传代培养，为进一步研究nsc特性以及进行基因操作奠定基础。方法无菌条件下分别取胚龄8～9周及胚龄16周水囊引产胎儿的大脑和延髓组织（孕16周人胚标本主要取大脑的室管膜下区组织），分别用1times105/ml及1times107/ml的密度分离培养原代nsc，应用悬浮及贴壁培养的方法进行传代培养，悬浮培养的nsc用机械吹打法传代,贴壁培养的nsc用胰酶消化法传代。用免疫细胞化学的方法对所分离nsc的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果（1）以1times105/ml为起始密度的原代培养物中，仅取自9周人胚大脑皮层的培养物中形成少量神经球。以1times107/ml为起始密度的原代培养物培养10天左右，均可见少量桑椹状神经球形成（见图1），同时存在大量含神经球及其它杂细胞的不规则悬浮细胞团片。相同胚龄及起始密度的人胚nsc，源自延髓的培养物神经球形成较源自大脑的培养物晚，数量较少。（2）悬浮培养的人胚nsc机械吹打传代时可造成大量细胞死亡，同时神经球不能被有效分散。持续增殖的神经球直径可达1mm以上，中心部分呈棕黑色，增殖能力下降。悬浮培养的人胚nsc可稳定增殖90天左右。人胚nsc诱导贴壁3～4天后，小神经球可展开呈单层，菊花状；较大的神经球贴壁后，中心部分仍含多层细胞（见图2）。胰酶消化法传代时，神经球较易分散，细胞死亡相对较少，贴壁培养的人胚nsc可传至15代（稳定培养4月余）。（3）悬浮培养及贴壁培养的人胚nsc，抗巢蛋白(nestin)及抗brdu免疫细胞化学染色,均显示阳性(见图3、4)。加入5％胎牛血清诱导分化后，可显示出抗微管相关蛋白2（map2）、神经胶质酸性蛋白（gfap）染色阳性的细胞(见图5、6)，人胚nsc分化后2，3－环核苷酸磷酸二脂酶（cnp）的染色效果不佳。结论采用高密度悬浮培养法能有效的从两种胚龄的人胚全脑或室管膜下区中分离出nsc，贴壁培养法较悬浮培养法更有益于人胚nsc的长期稳定增殖，是进一步进行人胚nsc转基因研究的良好模型。关键词人胚胎神经干细胞细胞培养